飼料養分生物學效價評定的宗旨是為了揭示飼料被畜禽采食后消化、吸收，經過動物循環系統進入相應的組織器官，再轉化為畜產品的過程。在表達消化、代謝、轉化的過程及其涵義方面，前人曾提出種種倡議。Fox將“生物學效價”定義為“飼料中某種養分支持生物機體結構與機能正常的量化估測”；Sibbald(1987)認為“生物學效價”是一種抽象的概念，是養分進入體組織后用于正常代謝機能的效益；Ammerman將“生物學效價”定義為：動物食入營養素中能被小腸吸收并參與代謝過程或貯存在動物組織中的部分占食入總量的比值；許振英將生物學效價剖分為“絕對生物學效價”與“相對生物學效價”兩類概念；張子儀認為“飼料生物學效價”應包括消化率(digestibility)、吸收率(absorbability)、代謝率(metabolizability)、同化(assimilation)、有效性(utilization)、可利用率(availability)乃至飼料組合效應(associ ative effect of feeds)等多重涵義。
    在生物學效價的評定手段上，動物營養學家們在消化能、代謝能和凈能的測試手段、立論依據、數學模型等方面進行過大量的研究。最早可溯及法國化學家拉瓦錫(Lavaisier Antoine Laurent，1743～1794)創建的小型動物呼吸代謝熱量測定裝置，他首次否定了“燃素說”，命名氧元素為“oxygen”，闡明了燃燒作用的氧化學說，再一次證實了“質量守恒定律”。經過近兩個多世紀的科研實踐，迄今消化能和代謝能測值仍然是“凈能體系”賴以成立的關鍵性決策依據。但是經過實踐，許多學者從不同角度對飼養標準中的有效能值采用凈能體系提出質疑，如Wiseman和Cole認為凈能值太敏感不適宜實際應用；美國NRC的專家們認為凈能的測定太困難、不精確和受影響的因素太多；Emmans總結指出：能量用于維持和脂肪沉積、蛋白沉積的效率是不一樣的，因此不能用“凈能”來簡單描述；Whittemore認為凈能指標并不比消化能、代謝能指標為優化飼料配方或預測生產成績提供更為精確的信息。因此，當前對飼料能量生物學效價評定的一個共識仍然是像Fuller指出的那樣：“一個體系越是追求生產過程中的實際情況，則其測值更易受動物的影響，變異就更大，因此也相應更不精確”。
    縱觀國內外對于飼料能量生物學效價的種種評定方法，可以認為在生物學效價的概念上，評定方法、手段的邏輯性上，理論與實踐的結合上都存在許多懸而未決的問題，應該承認當前被長期沿用的種種傳統生物學效價評定方法大多是屬于約定俗成的權宜之計。基于以上認識，本文對in vitro消化法方面的研究歷史進行了簡要回顧，大體上可分為“單一胃酶in vitro消化”階段、“胃-腸酶多步法in vitro消化”階段及作者等正在探索中的“電腦仿生程控三步消化法”三個歷史進程。為了尋求便捷、實用、可信的飼料養分生物學效價評定方法的科學技術路線，作者等曾對Furuya用“胃蛋白酶-豬小腸液”(PIF)的in vitro法測定消化能的方法及存在的問題進行了驗證，初步認識到“以還原論為指導思想，將任何局部運動之和等同為整體的理念將很難解決傳統方法中存在的種種弊端”。基于以上認識，作者等從單胃動物豬、禽的仿生酶譜的建立，酶水解環境的標準化乃至電腦程控消化系統中必須高度關注的關鍵性技術的全程仿生優化組合技術路線及實施方案進行了整體規劃。復雜問題的簡單化必須從零開始，需要通過大量實踐檢驗才有可能達到日趨客觀的現實。基于以上認識，本文首先回顧了用in vitro酶水解法評定豬飼料消化能(DE)及氨基酸利用率(AAA)的簡史，作者等基于用仿生消化電腦程控系統評定豬飼料EHGE的現狀及進程，最后對用仿生酶消化電腦程控系統評定飼料養分生物學效價的現實意義及應用前景進行了展望。希望能集思廣益，得到同行們的支持與批評指正。
1 國內外用in vitro 消化法評定豬飼料消化能的研究進展概況
    由于動物代謝試驗法耗資、費力、效率低，重演性、可比性差，同時測值又受到種種測試條件的限制，因此，自20世紀50年代以來，許多學者在通過in vitro法或insitu法，在探索模擬飼料養分在畜禽體內的消化代謝規律的基礎上提出了種種簡捷、易于執行的飼料養分生物學效價的評定方法，并在研究動物消化酶的變異規律及其對不同養分的水解環境，從不同的角度進行過大量工作。但從文獻報道的頻率和實際應用方面則顯得不夠系統。總體來說是時起時落，尤其在in vitro消化法的研究方面，更顯得分散。粗略概括，大致是從早期的簡單模擬胃酶消化過程到中期的模擬胃、腸道多步消化，最后向近期的全消化道仿生酶譜的建立到電腦仿生程控的方向發展。
1.1 簡單胃酶消化法
    最早Sheffner等用胃蛋白酶對飼料進行了in vitro消化試驗，并用以評定飼料或食物中蛋白質的生物學價值。該法見于AOAC等早期版本，作為測定動物性蛋白質飼料消化率的經典方法沿用至今。我國也于1999年根據等同采用原則將該法列入飼料行業中的國家級推薦標準(GB/T17811-1999，GB/T17811-2008)。此外，有關木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶和凝乳酶等方面的報道不勝枚舉。胃部的主要消化酶是胃蛋白酶，其他酶的含量較低，一般忽略不計。用胃蛋白酶水解法評定飼料或食物的可消化性，雖然只能反映在規范水解條件下對某一飼料或食物中的蛋白質生物學效價的一個片面評價。由于這種方法便捷、重復性好、可比，而且醫藥用胃蛋白酶產品早已標準化，因此，仍然作為一種相對參比值被相關行業廣泛接受。
1.2 胃一腸酶多步水解法
    鑒于用單一胃酶法評定飼料生物學效價的局限性。從20世紀70年代以后，許多學者在單一胃酶處理的基礎上用胰液、豬小腸液(porcine intestinal fluids，PIF)以及商品復合酶(如Viscozyme)乃至20%磺基水楊酸(PSA)等用于飼料有效能或蛋白質氨基酸的“生物學效價”評定。
    Goering和VanSoest最早用胃蛋白酶-豬小腸液(PIF)的in vitro消化方法，估測了飼料淀粉、粗蛋白的消化率和日糧纖維的降解率。這主要是基于日糧干物質和粗蛋白的in vitro消化率測值與體內消化率測值之間存在著較好的相關性。
    Furuya等在系統研究了豬胃蛋白酶及PIF的最佳水解環境條件之后，提出了用胃蛋白酶及PIF凍干粉水溶液模擬胃腸兩步消化的in vitro法。Lowgren等在該法的基礎上，采用十二指腸液處理12h，再用回腸液和糞提取液處理48h，粗略評價了豬飼料樣品的in vitro干物質消化率。
    張子儀等(1982～1984)在前人工作的基礎上，系統比較了從不同品種豬、飼喂不同類型日糧、不同瘺術部位采集的PIF酶活效價、鮮PIF與PIF凍干粉水溶液的酶活效價的差異，并在PIF凍干粉的保質期、用PIF法測值的精度、重演性、可加性以及PIF法測值與全收糞法測值間的相關關系開展了必要的性能檢驗。通過兩者之間的相關關系建立了以in vitro法為變量，以全收糞法為因變量，提出了豬飼料消化能值的回歸公式。經過“七五”國家攻關全國協作及科研教學單位驗證后，總結出了以胃蛋白酶和豬小腸液凍干粉水溶液處理為主要手段的in vitro消化試驗方案。該法已被中國飼料工業協會、中國農科院飼料所主編的《飼料生物學效價評定技術規程》所采納。由于該方案是手工操作，因此，受豬小腸液的采集、凍干粉的制備、貯存條件、水解環境的標準化以及試劑盒的貯存條件、保質期、售后服務以及測試者的素質培訓等客觀社會條件的限制，迄今該方法仍然難在生產上被廣大用戶接受。
    此后，盧福莊等、杜榮等、李文英等還曾用PIF法與全收糞法的雞日糧代謝能值進行了對比。在此前后，Drake曾用胃蛋白酶、胰酶連續透析法研究了畜禽對淀粉的消化率。Savoie和Gauthier、Derosicrs等曾用分子量為1000Da的透析袋在自制消化裝置中模擬了飼料蛋白質的in vitro消化方法，研究了熱處理乳清蛋白中賴氨酸的破壞程度和食物中蛋白質的in vitro消化率。
    在這歷史時期，Dierick曾提出用胃蛋白酶制劑與胰酶制劑水解處理為標志的in vitro兩步法。
    在測定豬的能量消化率及蛋白質、氨基酸利用率方面也取得了令人滿意的結果，但都限于所用酶制劑的標準化問題、以及試劑盒開發中的技術規范問題是否能達到腸道全程仿生效果，尚待進一步研究。
    進入20世紀90年代，Bosien等、Boisen和Fernandez等、Bosien等前后報道了用胃蛋白酶-豬胰酶及Visozyme評定了飼料干物質、有機物、粗蛋白質和能量in vitro消化率，并與體內法對比測定后，獲得令人滿意的結果。
    加拿大學者Regmi等以三角瓶為反應器，用胃蛋白酶-胰酶-“Viscozyme”①“PSA”②處理為主線的模擬胃腸水解環境及水解產物分離為目標的in vitro法，提出了預測生長豬對大麥樣本全消化道能量表觀消化率(apparent total tract digestibility，ATTD)的回歸模型(y=1.23x-25.33；R2=0.97)。
    綜上所述，從仿生消化法研究的歷程分析，其初衷都是以便捷為前提，為獲取趨近于可信的生物學法信息為目標，以精度、重演性好為約束條件。從上述單一胃消化法與胃腸酶消化多步法的設計原則分析，基本上如出一轍。從各家在選定的消化酶或商品消化酶產品的功能分析方面也都難免有以點代面，以面代全之嫌，在實際操作中又存在著酶譜設計、酶活力乃至酶與酶、外源酶與內源酶之間互補頡頑，以及手工操作中不可回避的種種未知因素的干擾。因此，作者等認為：沿用了近一個世紀的各種方案，都有必要互通有無，取長補短，在模擬全消化道酶水解體系的仿生學方面作進一步努力。
1.3 仿生酶消化法
    進入21世紀前后，許多學者又沿著胃蛋白酶-胰酶-Viscozyme法的技術路線，在重演性方面進行了類似研究。在Boisen等研究基礎上，Noblet等又用胃蛋白酶-胰酶-Viscozyme系統分析了115種復合飼料和68種飼料成分。肯定了該體系對生長豬的飼料中有機物以及代謝能和凈能的生物學效價評定方面具有可重復性。但是同時也指出該系統實驗操作過程相對復雜。Kim也指出在水解產物中油脂分離的重復性較差。
    Boisen本人也指出該系統中在模擬消化液的制備、緩沖液的組成及水解時長等方面存在著操作者之間的隨意性等遺留問題。
    總體回顧，在諸多的國內外研究者公開報道的酶消化體系的in vitro測試手段方面，基本上停留在以三角瓶、透析管、搖床等為組件的手工操作階段，人為設定酶譜條件下獲得的信息。無論從仿生的角度及從所獲參數的可比性與可重復性等方面都具有很大的局限性。為此，本研究組從20世紀后期開始，就仿生酶譜的設計定型依據，消化過程中水解環境、消化液的加入、乃至水解產物的分離，飼料樣品的制備、仿生酶消化系統、透析膜的篩選、飼料樣本量與消化酶的配套用量、緩沖液的配制(離子濃度、緩沖體系、pH等)、反應溫度、消化時長等因素的標準化與規范等方面的立論依據開展了研究，在此基礎上開發了第一代到第三代“單胃動物仿生消化系統”。
2 仿生酶消化法的發展目標
    回顧早期工作，基本是屬于探索到追蹤的過程。進入21世紀，雖然在影響單胃動物消化酶譜的因素及其發育變異規律方面進行了必要研究，但仍屬初學階段，更復雜的問題乃至在傳統飼料養分的生物學效價評定方面的難題還有待努力探索與深入研究。
    基于“仿生”這主題本身就是一個永恒的課題，因此，因此作者等認為：攻堅的程序也只能以“已知”求“未知”。一蹴而就、一次到位是困難的，也是不可能的。
    基于以上認為：(1)為了能更趨近于動態宿主主體在特定時間、空間條件下獲取飼料營養價值的客觀信息，首先應該在傳統飼料營養評定工作的理論、涵義、評定手段等方面作整體反思，并能在被現代養殖業與飼料工業所急需的便捷手段上尋求可行性技術路線。(2)在尚未能一次性獲得公允方案之前，所有創新方案應具備以下條件：
    ①在規定試驗研究條件下所獲得的信息或參數必須具有可信的精度和重演性，有利于對過去及未來的科研信息在同一條件下可比、可重演，以有利于用傳統法或種種倡議生成數據的吐故納新、淘而不汰；②飼料生物學效價評定項目名詞術語應在相關信息管理系統的約束規定條件下標準化。繁簡的度也應從生產實際出發，作出適度的選擇(如DE-ME-NE-NEm)；③對試驗動物特別是“荷術動物”(hostal animal)應在動物福利(animal welfare)理念下更新觀念，提出試驗動物必須是在健康、舒適、無應激的飼養環境下所獲得的信息；④不同種類、不同生長階段的畜禽飼料養分生物學效價仿生評定系統也應擇重、漸進、組織全國分期分批有計劃地協作完成。
3 結語
    對傳統的以“套算法”為立論依據的豬單個飼料營養價值評定體系，許多學者從組合效應及邏輯學等角度提出質疑。作者等認為：鑒于豬是雜食動物，從仿生學角度分析，其難度應是介于反芻動物與禽類之間的復雜問題。從國情考慮，還面對著以配合飼料為主的規模化養殖業體系與有啥喂啥的千家萬戶養殖業體系。因此，在建立仿生酶消化法體系時，應從我國養豬業的整體考慮，應注意“粗飼料類型日糧”與“精飼料類型日糧”兩大飼料飼養體系的背景，審時度勢，擇重優化技術路線。