體外法評定反芻動物飼料營養(yǎng)價值方法匯總
反芻家畜粗飼料營養(yǎng)價值的評價方法較多，各具利弊，可根據(jù)需要選擇方法，體外產(chǎn)氣技術(shù)具有明顯優(yōu)勢。反芻動物飼料營養(yǎng)價值的評價除了考慮消化后終產(chǎn)物與動物生產(chǎn)性能之間的相互關(guān)系，還要考慮微生物、飼料成分和影響飼料利用的各種因素。
體外評定技術(shù)是用活體外測定方法評定反芻動物飼料營養(yǎng)價值的一系列方法與技術(shù)，可避免體內(nèi)法的一些不足。體外評定法從20世紀(jì)50年代出現(xiàn)，主要有體外產(chǎn)氣法、兩步法；20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的人工瘤胃持續(xù)發(fā)酵法；20世紀(jì)80年代末開始應(yīng)用的近紅外反射光譜技術(shù)，另外還有酶解法及溶解度法等。體外法與體內(nèi)法、半體內(nèi)法相比較，具有操作簡便、容易標(biāo)準(zhǔn)化、結(jié)果重演性好等優(yōu)點，從而得到了較廣泛的應(yīng)用。
1 體外產(chǎn)氣法
1.1 原理
體外產(chǎn)氣法(invitrogasproduction)是基于飼料樣品在體外用瘤胃液消化所產(chǎn)生CO2和CH4氣體的比率來估計有機物消化率的快速方法。其原理是：消化率不同的飼料，在相應(yīng)的時間內(nèi)(一般為24h)產(chǎn)氣量與產(chǎn)氣率不同。用該法測得的有機物消化率與在反芻動物活體內(nèi)測定的結(jié)果呈顯著正相關(guān)。瘤胃降解與氣體產(chǎn)量之間的關(guān)系很早就被關(guān)注，但直到20世紀(jì)40年代才開始測定瘤胃的氣體產(chǎn)量。用體外產(chǎn)氣法評價飼料飼用價值的技術(shù)較為廣泛。任瑩等(2009)試驗結(jié)果表明：花生藤、木薯渣、檸檬酸渣和甜葉菊渣這幾種飼料可以作為反芻動物的新型飼料資源加以推廣利用，而且用體外產(chǎn)氣法評定反芻動物飼料的營養(yǎng)價值是可行的。
1.2 影響因素
1.2.1 樣品
底物的量、樣品的粒度、樣品的干燥度都會影響結(jié)果。熊本海等(2001)在利用體外法研究飼料的產(chǎn)氣曲線及5種養(yǎng)分的發(fā)酵系數(shù)時，取底物量分別為200、400、600和800mg進(jìn)行預(yù)備試驗，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用量為200mg時，因量太少，黏附在培養(yǎng)瓶上的底物對試驗的誤差影響大，而當(dāng)?shù)孜餅?00mg以上，觀察到有較明顯的底物發(fā)酵不完全現(xiàn)象。根據(jù)前人研究得出，400mg粗飼料做底物發(fā)酵特性比較理想。粒度0.4~1mm范圍內(nèi)，在65℃下干燥20h，產(chǎn)氣曲線與新鮮樣品的曲線非常接近。高溫干燥牧草對產(chǎn)氣曲線有負(fù)面影響，用該法時要注意樣品的干燥度。
1.2.2 瘤胃液
瘤胃液與緩沖液通常以1:2的比例混合，緩沖液應(yīng)能中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的VFA(揮發(fā)性脂肪酸)使pH值恒定，提供足夠的礦物質(zhì)保持微生物活性。飼前采集瘤胃液，此時瘤胃液活性和組成最穩(wěn)定。為更好地保證瘤胃液活性，需采集至少2頭試驗動物的瘤胃液進(jìn)行混合。培養(yǎng)時，注射器和收集瓶要放在(39±0.5)℃的水浴搖床中進(jìn)行，注意攪拌均勻，讀數(shù)的時間依培養(yǎng)的底物類型而定，對于牧草，通常為3、6、12、24、48、72和96h，而對于精料在24h以前需增加讀數(shù)次數(shù)。
1.3 應(yīng)用
體外產(chǎn)氣法的自動化分析技術(shù)已經(jīng)取得了進(jìn)展，其中注射器式和壓力傳感器使用比較普遍。1.3.1注射器式系統(tǒng)
將底物和緩沖后的瘤胃液放入具活塞的玻璃注射器(100mg)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24h發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣量與體內(nèi)測定的消化率具有高度的相關(guān)性。此外，利用24h產(chǎn)氣量和其他化學(xué)成分還可估測飼料代謝能。該體系容易操作，且能同時進(jìn)行大量樣本分析。
Blümmel和Φrskov(1993)對該方法進(jìn)行了改進(jìn)，用溫控水浴搖床取代了Menke等(1979)試驗中帶轉(zhuǎn)子的培養(yǎng)箱，這樣在讀數(shù)時，培養(yǎng)體系的溫度降低很小，有利于對不同時間點讀數(shù)的發(fā)酵動力學(xué)研究。
1.3.2 壓力傳感器式系統(tǒng)
將飼料和瘤胃培養(yǎng)液密封在約50mL的血清瓶中，血清瓶單獨與壓力傳感器相連，利用傳感器把培養(yǎng)過程中產(chǎn)生氣體的壓力轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)傳輸?shù)诫娔X，通過產(chǎn)氣量研究粗飼料的降解動力學(xué)。該體系可對產(chǎn)氣量自動持續(xù)地記錄，但當(dāng)?shù)孜锪看笥?00mg時，因產(chǎn)氣量超過可記錄限度，體系將無法工作；當(dāng)?shù)孜锪刻。a(chǎn)生的樣品誤差也會很大。Mauricio等(1999)改進(jìn)了該方法，將傳感器直接同電腦相連，快速記錄壓力數(shù)據(jù)，然后在大氣壓下利用注射器針頭排出瓶中累積的氣體，達(dá)到平衡后重新培養(yǎng)，改進(jìn)后的方法更為快速和方便，得到廣泛應(yīng)用。該法的優(yōu)點是能同時對大量樣本測定、成本低，但該法培養(yǎng)液的成分很多，配制較復(fù)雜，有些步驟需要無菌操作。
1.3.3 注射器式和壓力傳感器式系統(tǒng)之間的比較
注射器系統(tǒng)所建立的體外產(chǎn)氣量與體內(nèi)的關(guān)系以及各種模型和公式已經(jīng)得到了普遍認(rèn)同。但與壓力傳感器式系統(tǒng)相比，注射器系統(tǒng)所用底物量少，發(fā)酵后殘留物不便或不足用作其他分析。大多數(shù)注射器發(fā)酵時，如要對培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行取樣和測定則需終止培養(yǎng)，且注射器狀培養(yǎng)器價格較昂貴。壓力傳感器式系統(tǒng)可以克服這些缺點，但所得結(jié)果與注射器式系統(tǒng)存在差異。當(dāng)?shù)孜锪啃Ｕ?00mg時，兩個系統(tǒng)培養(yǎng)所得的潛在產(chǎn)氣量無顯著差異，但是短時間內(nèi)壓力傳感器系統(tǒng)的產(chǎn)氣量明顯低于注射器系統(tǒng)，而前者的產(chǎn)氣速率要慢于后者，兩個系統(tǒng)24h的產(chǎn)氣量存在著很強的相關(guān)性。迄今為止，兩系統(tǒng)所得結(jié)果尚不能直接比較，在注射器系統(tǒng)中已經(jīng)形成的模型與公式也不能用于壓力傳感器式系統(tǒng)中。