3 飼料中硝基呋喃類藥物檢測研究概況與進展
    文獻報道有關硝基呋喃類殘留的檢測方法很多，主要有高效液相色譜法(HPLC)、超高壓高效液相色譜法(UPLC)、液相色譜-質譜法、液相色譜-串聯質譜法、免疫分析法、分光光度法等。
3.1 高效液相色譜法(HPLC)
    高效液相色譜法(HPLC)在硝基呋喃類抗生素的檢測中比較常見，HPLC法所用的檢測器文獻報道較多的有紫外檢測器(UV)，二極管陣列檢測器(DAD)和電化學檢測器(ECD)。
3.1.1 液相色譜- 紫外檢測器(LC-UV) 在硝基呋喃類抗生素原藥化合物的檢測中高效液相色譜應用最多，而高效液相色譜最常用的檢測器就是紫外檢測器(UV)。配合使用固相萃取(SPE)前處理凈化技術，高效液相色譜(配有紫外檢測器)法快速測定雞肉、魚、蝦中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮藥物殘留量，4種硝基呋喃類藥物在雞肉、魚、蝦樣品中3個不同水平的添加回收率為87%～102%；相對標準偏差(RSD)為2.0%～7.8%；工作曲線的線性范圍為5μg/kg～100μg/kg；呋喃它酮、

 呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮的檢出限分別為5μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、2μg/kg。另有文獻報道利用高效液相色譜法(配有紫外檢測器)測定水產品中呋喃唑酮的殘留量，其方法靈敏度高，檢測限為1.0μg/kg。
3.1.2 液相色譜- 電化學檢測器( L C - E C D )
    電化學檢測器( E C D ) 因其高靈敏性也在硝基呋喃類抗生素的檢測中得到應用。利用HPLC-ECD來檢測牛奶中的呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮，檢測限分別為5ng/mL、4ng/mL、4ng/mL。在4ng/mL、10ng/mL、25ng/mL的添加回收率分別為85%～97%、87%～97%、83%～98%。利用改進的HPLC/ELCD高效液相色譜電化學檢測器檢測雞組織和雞蛋中的呋喃唑酮和鹽酸呋喃它酮，其回收率為80.0%～99.0%；呋喃唑酮的檢測限為1ng/g，鹽酸呋喃它酮的檢測限為2ng/g。
3.2 聯用技術分析法
    色譜技術廣泛應用于多組分混合物的分離和分析，特別適合有機化合物的定量分析，但定性較困難；質譜儀只能夠對單一組分提供高靈敏度和特征的質譜圖，但對復雜化合物分析無能為力。將色譜和質譜技術進行聯用，對混合物中微量或痕量組分的定性和定量分析具有重要意義。由于硝基呋喃類抗生素對光敏感，具有代謝快速的特點，在動物體內的半衰期不過數小時，通常在飼料或者動物性食品中硝基呋喃類抗生素及其代謝產物往往同時存在，利用色譜和質譜聯用技術將大大提高分析的靈敏度、特異性和準確性。
    對硝基呋喃類代謝物殘留的分析，因其低的質量和微弱的紫外吸收特性使分析檢測變得困難。因此為了誘導分子紫外吸收，通常將代謝物用2-硝基苯甲醛(2-nitorbenzaldehyde，2-NAB)進行衍生化，以使其代謝物能被液相色譜紫外檢測器檢測到。硝基呋喃代謝產物(AOZ，AMOZ，SEM，AHD)可在酸性條件下被水解，可同時用2硝基苯甲醛(2-nitrobenzaldehyde，2-NBA)衍生化。
3.2.1 液相色譜- 質譜法(LC-MS)
    應用HPLCDAD(光二極管陣列檢測器)檢測雞蛋中硝基呋喃類藥物殘留并用HPLC-MS進行確認。呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮利用HPLC-MS方法檢測限分別為3.2μg/kg、1.6μg/kg、1.0μg/kg。可見LC-MS是一種靈敏度高、選擇性好、特異性強、快速的分析確證硝基呋喃類藥物殘留的方法。但是其儀器設備的購置和運行費用較高,成為常規分析方法尚有一定困難。
3.2.2 液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)
    最近幾年用于檢測硝基呋喃類抗生素的代謝物的LC-MS/MS方法發展迅速，它是一種靈敏度更高、選擇性更好、特異性更強的方法，目前許多國家已將LC-MS/MS方法作為檢測硝基呋喃類抗生素代謝物的確證性方法。采用電噴霧電離(ESI)，選擇反應監測(SRM)模式、三離子原則、外標法定量，建立了硝基呋喃代謝物多殘留檢測方法，定量限為0.1ng/g～0.5ng/g,檢測限為0.5ng/g～0.1ng/g。另有文獻報道依次用甲醇、乙醇和乙醚溶劑提取，使動物源性樣品中4種硝基呋喃類游離態代謝物進入提取液，而結合態代謝物保留在殘渣中，在酸性條件下用2-硝基苯甲醛分別衍生游離態和結合態代謝物，經乙酸乙酯提取濃縮后，用液相色譜-四極桿串聯質譜儀定性，同位素內標法定量，回收率為85.2%～112.5%，檢出限均為0.3μg/kg。也有對動物組織中4種硝基呋喃類代謝產物AMOZ、AHD、SEM、AOZ的同位素稀釋HPLC-MS/MS線性組合分析方法，以2-基苯甲醛作為衍生化試劑，AMOZ-d5、AOZ-4作內標，用乙酸乙脂提取，用自制的凈化試劑凈化，以乙腈-0.1%甲酸為流動相，采用梯度洗脫，可適應不同種類的動物組織樣品前處理，15min可將4種代謝產物完全分離并測定。提出了HPLC-MS/MS多重反應監測線性組合法的原理并進行了驗證，回收率為85%～118%；定量限(LOQ)為0.1μg/kg；檢出限(LOD)為0.03μg/kg。蜂蜜及水產品中四種硝基呋喃代謝物多殘留的LC-MS/MS方法，AOZ檢出限為0.02ng/g。雞蛋中呋喃唑酮代謝物的殘留測定方法，AOZ線性范圍0.05μg/L～5.00μg/L，最低檢測限為0.05μg/L。
3.3 超高效液相色譜法(UPLC)
    超高效液相色譜是一個新興的領域，作為世界第一個商品化UPLC產品的WatersACQUITYUPLCTM超高效液相色譜系統也是剛剛出現。與傳統的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。因此其在蛋白質、多肽、代謝組學分析及其它一些生化領域里將會得到廣泛應用。另外，在天然產物的分析方面，使用UPLC與質譜檢測器連接，會對天然產物分析，特別是中藥研究領域的發展是一個極大的促進。應用超高效液相色譜(UPLC)同步檢測飼料中3種硝基呋喃類藥物，采用微波萃取方法提取樣品中的呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮，提取溶劑為乙腈，提取條件為80℃下微波萃取10min；用OasisTMMCX小柱凈化，流動相為0.3%的冰醋酸溶液：乙腈(體積比)=90∶10，流速為0.4mL/min，進樣量為5μL。
    在上述試驗條件下，呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮的保留時間分別為1.69min、1.99min和2.40min，檢出限分別為0.01μg/mL、0.015μg/mL、0.01μg/mL，平均回收率分別為84.6%～92.3%、80.0%～92.3%、83.8%～92.3%，在0.05μg/mL～10μg/mL范圍內有良好的線性關系。該方法簡便、省時、靈敏度高，可同時測定飼料中呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮的含量。
3.4 免疫分析法(IA)
    酶聯免疫分析法(ELISA)是最為常用的方法，此方法的優點是靈敏度高、操作簡便、檢測迅速;缺點是仍不能實現在線檢測，而且假陽性率較高。目前已經建立了呋喃唑酮間接競爭ELISA檢測法，將呋喃唑酮與牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)聯接，分別作為免疫原及包被原，并建立了水產養殖動物組織中呋喃唑酮的ELISA篩選方法，測定的最適范圍為10ng/mL～100ng/mL，最小檢測限為1ng/mL。
    ELISA方法的孔間差異為4.16%，板間差異為9.20%，試驗重復性好，添加回收率試驗測得蝦肉樣本平均回收率為94%,在試驗濃度范圍內，呋喃唑酮的抗血清與呋喃西林的交叉反應性為43%，與其它藥物未顯示免疫交叉反應性。應用進口的呋喃唑酮試劑盒檢測呋喃唑酮及其代謝物AOZ，平均檢測下限約為50ng/kg。
    根據樣品的前處理情況，可以得出樣品的檢測下限為100ng/kg，禽肉的回收率大約為80%～90%。該試劑盒特異性強，但仍無法同時一次性檢測多個硝基呋喃類代謝物殘留。
    目前國外已有呋喃唑酮、呋喃它酮代謝物商品化的試劑盒開發出來,而我國只能靠引進國外的試劑盒,現在各商檢部門所使用的和各生化試劑公司出售的都是德國r-Biopharm公司生產的試劑盒,其價格昂貴。
3.5 分光光度法
    分光光度法主要是用來測定動物飼料中呋喃唑酮等硝基呋喃類藥物添加劑。利用分光光度法測定飼料中的呋喃唑酮，這種方法是將飼料試樣中的呋喃唑酮用二甲基甲酰胺(DMF)提取出來，使其與苯肼鹽酸溶液反應，產生亮黃色的反應物，再用甲苯萃取后，在440nm處用分光光度計讀取其吸光值，從而進行測定。此方法測定簡便，線性相關系數r≥0.9995,試樣回收率在95%～102%之間。此方法操作簡單，不需要昂貴的儀器，且可以判定動物性產品中是否存在硝基呋喃類藥物，因而在設備不完善的部門有一定的推廣價值。但是靈敏度較低，不能作為確證的方法，在實際生產中應用很少。

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